La spectrophotométrie est une technique de mesure qui repose sur l’interaction entre la lumière et la matière. En biologie, elle est largement utilisée pour analyser des molécules, évaluer leur concentration et suivre des réactions biochimiques en temps réel. Son principe fondamental est basé sur la loi de Beer-Lambert, qui relie l’absorbance d’une solution à la concentration de la molécule absorbante.
I. Principe général de la spectrophotométrie
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Une lumière de longueur d’onde définie traverse un échantillon.
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Une partie de la lumière est absorbée par les molécules présentes, l’autre est transmise.
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Le spectrophotomètre mesure l’absorbance (A), qui est proportionnelle à la concentration de l’analyte :
où :
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= coefficient d’extinction molaire (spécifique à la molécule),
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= concentration de la solution,
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= longueur du trajet optique (cm).
II. Les principaux types de spectrophotométrie en biologie
1. Spectrophotométrie UV-Visible
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Domaine spectral : 200 – 800 nm.
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Applications :
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Quantification des acides nucléiques (ADN, ARN) :
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Absorbance à 260 nm (A260).
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Ratio A260/A280 pour estimer la pureté (≈1,8 pour l’ADN, ≈2,0 pour l’ARN).
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Quantification des protéines :
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Absorbance à 280 nm (tryptophane, tyrosine).
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Dosage colorimétrique (Bradford, Lowry, BCA).
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Suivi enzymatique : mesure de l’évolution de l’absorbance d’un substrat ou produit (ex : NADH à 340 nm).
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2. Spectrophotométrie infrarouge (IR)
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Domaine spectral : 700 nm – 1 mm (infrarouge moyen : 4000–400 cm⁻¹).
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Principe : mesure des vibrations moléculaires (liaisons chimiques).
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Applications :
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Identification des groupes fonctionnels dans les biomolécules.
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Étude de la structure secondaire des protéines (bandes amide I et II).
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Analyse de la composition cellulaire et des membranes.
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3. Spectrophotométrie de fluorescence
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Principe : une molécule absorbe la lumière à une certaine longueur d’onde (excitation) et réémet à une longueur d’onde plus grande (émission).
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Applications :
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Détection sensible d’ADN/ARN (colorants : SYBR Green, Hoechst).
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Marquage de protéines par des fluorophores (FITC, GFP).
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Suivi des interactions moléculaires (FRET : transfert d’énergie par résonance de fluorescence).
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Analyse du calcium intracellulaire (sondes fluorescentes).
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4. Spectrophotométrie de masse optique (circular dichroism, CD)
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Utilisée pour étudier la structure secondaire des protéines et acides nucléiques.
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Mesure l’absorption différentielle de la lumière polarisée circulairement.
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Applications : suivi de la dénaturation protéique, interactions ADN-protéines.
5. Microvolume spectrophotométrie (Nanodrop™)
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Permet la mesure directe de la concentration d’ADN, ARN ou protéines avec un très petit volume (1-2 µL).
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Application courante dans les laboratoires de biologie moléculaire.
III. Applications de la spectrophotométrie en biologie
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Analyse des acides nucléiques
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Quantification (A260).
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Vérification de la pureté (ratios A260/A280, A260/A230).
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Dosage des protéines
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Direct (A280).
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Indirect par colorimétrie (Bradford, Lowry, BCA).
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Cinétique enzymatique
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Suivi de la consommation ou de la production de cofacteurs (ex : NADH/NAD+).
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Études structurales
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Conformation des protéines (CD, IR).
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Interactions biomoléculaires (fluorescence, FRET).
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Diagnostic et biotechnologies
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Détection de biomarqueurs.
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Quantification d’anticorps et d’antigènes.
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Suivi de cultures cellulaires par mesure de densité optique (OD600 pour bactéries).
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Conclusion
La spectrophotométrie est une technique polyvalente et incontournable en biologie. Elle permet aussi bien l’analyse quantitative (dosage d’ADN, ARN, protéines) que l’étude qualitative (structure des biomolécules, interactions). De la simple mesure d’absorbance UV au suivi par fluorescence, elle reste un outil central en recherche fondamentale, en biotechnologie et en diagnostic médical.